Валидация ПЦР-тестов с наборами российского производства для выявления Ralstonia solanacearum sensu lato в растительных экстрактах

Проведена оценка применимости (валидация) двух тестов на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени и теста в формате FLASH c коммерческими наборами для выделения ДНК и для амплификации производства российских компаний ООО «АгроДиагностика» и ООО «Синтол», а также с использованием отечественных амплификаторов для выявления генетического материала комплекса возбудителей карантинного заболевания бурой бактериальной гнили картофеля Ralsto­ nia solanacearum sensu lato в растительном экстракте картофеля и роз. Аналитическая чувствительность тестов для большинства штаммов составила 102–103 КОЕ/мл. Повторяемость и воспроизводимость тестов на основе ПЦР в реальном времени зависели от используемого прибора. Значения рабочих критериев до 100% получены на детектирующем амплификаторе «ДТ-лайт» производства компании ООО «ДНК-Технология». На основании результатов испытаний наборы ООО «Агро-Диагностика» могут быть рекомендованы для проведения универсальных отборочных тестов при выполнении лабораторных исследований образцов подкарантинной продукции на выявление возбудителей видового комплекса. Тест с набором ООО «Синтол», специфичный к R. solanacearum расы 3 биовара 2, может быть использован для подтверждения положительного результата отборочного теста или в качестве отборочного при исследовании образцов из зон распространения R. solanacearum расы 3 биовара 2, а также для дифференциальной диагностики этой группы.

1. Дренова Н., 2019. Ожог плодовых культур в Российской Федерации и современные подходы к его диагностике. – Плодоводство и ягодоводство России, № 58: 131–137.

2. Дренова Н., Кузнецова А., 2012. Валидация метода FLASH-ПЦР для выявления возбудителя бурой бактериальной гнили картофеля Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. в картофельном экстракте. – ФГБУ «ВНИИКР», Быково, 28 с.

3. Ерохова М., 2020. Новая классификация бактерии Ralstonia solanacearum – возбудителя бурой гнили картофеля. – Защита и карантин растений, № 12: 6.

4. Завриев С., Рязанцев Д., Кошкина Т., 2007. Эффективный экономический метод чувствительной диагностики и идентификации патогенов картофеля. – Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и практики: материалы международного конгресса «Картофель. Россия – 2007», М.: 100–103. ISBN 978-5-7367-0643-3.

5. Корнев К., Копина М., 2012. Отчет о проведении лабораторных испытаний набора реагентов «Ralstonia solanacearum-РВ» для выявления возбудителя бурой гнили картофеля Ralstonia solanacearum раса 3 bv. 2 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). – Быково, 18 с.

6. Ребриков Д., Саматов Г., Трофимов Д. и др. ПЦР в реальном времени. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, 223 с. ISBN 978-5-9963-0086-0.

7. Егоров Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. – М.: МГУ, 1995, 224 с.

8. Стандарт ISO/IEC 17025:2017 «Общие требования к компетенции испытательных и калибровочных лабораторий».

9. СТО ВНИИКР 4.009-2013 «Возбудитель бурой бактериальной гнили картофеля Ralstonia sola­ nacearum (Smith) Yabuuchi et al. Методы выявления и идентификации».

10. Шнейдер Е., Дренова Н., Каримова Е., 2021. Карантинные для Российской Федерации бактериозы видов Ralstonia. – Фитосанитария. Карантин растений, 7 (3): 10–26.

11. Buddenhagen I., Sequeira L. & Kelman A., 1962. Designation of rases of Pseudomonas sola­ nacearum. – Phytopathology, 52: 726.

12. EPPO, 2004. PM 7/21 (1): Ralstonia sola­ nacearum. Diagnostic protocols for regulated pests. – EPPO Bulletin, 34: 173–178.

13. EPPO, 2018. PM 7/21 (2): Ralstonia sola­ nacearum, R. pseudosolanacearum and R. syzygii (Ralstonia solanacearum species complex). – EPPO Bulletin, 48 (1): 32–63.

14. EPPO, 2019. PM 7/98 (4): Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity. – EPPO Bulletin, 49 (3): 530–563.

15. Fegan M. & Prior P., 2005. How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. – American Phytopathological Society, St Paul, MN (US): 449–461.

16. Horita M., Tsuchiya K., Suga Y., Yano K., Waki T., Kurose D., Furuya N., 2014. Current classification of Ralstonia solanacearum and genetic diversity of the strains in Japan. – Journal of general plant pathology, 80 (6): 455–465.

17. Lenarčič R., Morisset D., Pirc M., Llop P., Ravnikar M., Dreo T., 2014. Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia so­ lanacearum. – PLoS ONE, 9 (4), e96027. URL: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0096027.

18. Lin C., Chuang M., Wang J., 2015. First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum on chard in Taiwan. – Plant Disease, 99 (2): 282.

19. Norman D., Bocsanczy A., Harmon P., Harmon C., Khan A., 2018. First report of bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum on blueberries (Vaccinium corymbosum) in Florida. – Plant Disease, 102 (2): 438.

20. Safni I., Cleenwerck I., De Vos P., Fegan M., Sly L., Kappler U., 2014. Polyphasic taxonomic revision of the Ralstonia solanacearum species complex: proposal to emend the descriptions of Ralstonia solanacearum and Ralstonia syzygii and reclassify current R. syzygii strains as Ralstonia syzygii subsp. syzygii subsp. nov., R. solanacearum phylotype IV strains as Ralstonia syzygii subsp. indonesiensis subsp. nov., banana blood disease bacterium strains as Ralstonia syzygii subsp. celebesen­ sis subsp. nov. and R. solanacearum phylotype I and III strains as Ralstonia pseudosolanacearum sp. nov. – Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 64: 3087–3103. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.066712-0.

21. She X., He Z., Li H., 2018. Genetic structure and phylogenetic relationships of Ralstonia solanacearum strains from diverse origins in Guangdong Province, China. – Journal of Phytopathology, 166 (3): 177–186.

22. Tjou-Tam-Sin N., van de Bilt J., Westenberg M., Bergsma-Vlami M., Korpershoek H., Vermunt A., Meekes E., Teunissen H., Van Vaerenbergh J., 2017. First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum in ornamental Rosa sp. – Plant Disease, 201 (2), 378 p.

23. Wicker E., Grassart L., Coranson-Beaudu R., Mian D., Guilbaud C., Fegan M., Prior P., 2007. Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. – Applied and Environmental Microbiology, 73 (21): 6790–801. URL: https://doi.org/10.1128/AEM.00841-07.

24. О потенциальных рисках, связанных с ввозом в страну бананов. Официальный сайт Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор). – URL: https://fsvps.gov.ru/fsvps/print/news/16317.html (дата обращения: 10.09.2021).

25. EPPO Global Database. – URL: https://gd.eppo.int (дата обращения: 30.09.2021).