Оценка применимости ПЦР-теста в режиме «реального времени» для идентификации возбудителя желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici

Возбудитель желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici (Carlson & Vidaver) Zgurskaya et al. входит в Единый перечень карантинных объектов Евразийского экономического союза. Быстрая идентификация возбудителя является важным элементом в сфере карантина растений. Метод ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) наиболее оптимален при проведении лабораторной диагностики. В настоящий момент существует только два теста ПЦР-РВ для идентификации Rathayibacter tritici, разработанные Postnikova et al., 2017. Тесты предназначены для идентификации Rathayibacter tritici в чистых бактериальных культурах. Сведения о значениях основных параметров применимости теста ПЦР-РВ – аналитической специфичности, включая эксклюзивность и инклюзивность, и аналитической чувствительности, – а также об испытаниях теста для обнаружения патогена в растительных образцах в оригинальной статье отсутствуют. Целью настоящей работы являлась оценка применимости ранее известных тестов ПЦР-РВ для идентификации R. tritici. Материалами исследований являлись штаммы R. tritici, а также 26 штаммов бактерий рода Rathayibacter, включая все существующие виды внутри указанного рода. В результате оценки применимости тестов ПЦР-РВ для идентификации возбудителя желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici было установлено, что значение инклюзивности – способности теста идентифицировать все многообразие штаммов бактерии внутри вида – для исследуемых тестов составляет 83,3%. Использование указанных тестов позволило идентифицировать 5 из 6 штаммов целевого объекта – Rathayibacter tritici. Значение эксклюзивности – способности теста отличать целевые штаммы от нецелевых – составило 100% для обоих тестов. Тесты ПЦР-РВ, разработанные Postnikova et al., 2017, несмотря на их высокую эксклюзивность (100%), неприменимы для фитосанитарной диагностики, поскольку в случае их применения достаточно высоким является риск ложноотрицательных результатов и, как следствие, проникновения карантинного фитопатогена на новые территории.

1. Белошапкина О.О., Писарева И.Н. Определение аналитической чувствительности и специфичности методов ПЦР для диагностики черной бактериальной пятнистости томата // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2024. Т. 1. №. 3. С. 78–94. doi: 10.26897/0021-342X2024-3-78-94.

2. Воронов Е.В., Словарева О.Ю., Десятерик А.А., Кондратьев М.О., Игнатов А.Н. Идентификация возбудителя стеблевого меланоза пшеницы Pseudomonas cichorii методом ПЦР в режиме «реального времени» // Вестник защиты растений. 2024. Т. 107, № 3. С. 121–129. doi: 10.31993/2308-6459-2024-107-3-16657.

3. Доморацкая Д.А., Игнатьева И.М., Кононова Е.П. Разработка новых диагностических ПЦР-тестов для выявления возбудителя бактериального увядания Clavibacter insidiosus // Генетические и радиационные технологии в сельском хозяйстве: Сборник докладов III Международной молодежной конференции, Обнинск, 23– 24 октября 2024 года. – Издательство НИЦ «Курчатовский институт» – ВНИИРАЭ. 2024. С. 34–36.

4. Каракай М.В., Игнатьева И.М. Опыт внедрения методов ПЦР-диагностики при выявлении и идентификации возбудителя бактериального ожога фасоли Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli // Фитосанитария. Карантин растений. 2024. № S2- 1(18). С. 14.

5. Оболенский Р.Р., Словарева О.Ю. Морфологические признаки Rathayibacter tritici на питательных средах NBY, YPGA и R2A // Фитосанитария. Карантин растений. 2024. № S2-1(18). С. 18.

6. Приходько С.И., Писарева И.Н., Корнев К.П., Бондаренко Г.Н., Валеева Н.Г., Радионовская Я.Э. Апробация различных методик выделения возбудителя бактериоза винограда (болезнь Пирса) Xylella fastidiosa Wells et al. в ходе научно-исследовательского мониторинга в условиях Республики Крым // Садоводство и виноградарство. 2021. № 1. С. 39–47. doi: 10.31676/0235-2591-2021-1-39-47.

7. Словарева О.Ю. Анализ производства и экспорта российского зерна и составление перечня регулируемых фитосанитарными требованиями стран-импортеров возбудителей бактериозов зерновых культур // Аграрный вестник Северного Кавказа. 2023. № 3(51). С. 47–54. doi: 10.31279/2949-4796-2023-3-51-47-54.

8. Словарева О.Ю., Трунов В.В., Присяжная Н.В., Дорофеева Л.В. Новые актинобактерии рода Rathayibacter из агробиоценозов регионов Российской Федерации // Фитосанитария. Карантин растений. 2024. № S2-1(18). С. 23.

9. Словарева О.Ю., Корнев К.П. Определение аналитической специфичности методов ПЦР для идентификации Acidovorax citrulli // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2020. № 51. С. 25–45. doi: 10.17223/19988591/51/2.

10. Тараканов Р.И., Игнатьева И.М., Белошапкина О.О., Чебаненко С.И., Каратаева О.Г., Джалилов Ф.С. Выявление возбудителя бактериального ожога сои Pseudomonas savastanoi pv. glycinea в семенах методом ПЦР // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2024. № 1. – С. 41–52. doi: 10.26897/0021-342X-2024-1-41-52.

11. Шашков А.С., Тульская Е.М., Стрешинская Г.М., Дмитренюк А.С., Потехина Н.В., Сенченкова С.Н., Пискунова Н.Ф., Дорофеева Л.В., Евтушенко Л.И. Рамноманнаны и тейхуроновая кислота из клеточной стенки Rathayibacter tritici ВКМ Ac1603T // Биохимия. 2020. Т. 85. № 3. С. 428–437. doi: 10.31857/S0320972520030124.

12. Обновленные фитосанитарные требования Бангладеша 2015 г. / Россельхознадзор. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. URL: chrome-extension:// efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/ https://fsvps.gov.ru/sites/default/files/fsvps-docs/ru/importExport/bangladesh/files/phyto_requirements_bangladesh.pdf (дата обращения: 10.01.2025).

13. Олиго Кальк: программа для расчета свойств олигонуклеотидов (праймеров). URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html (дата обращения: 03.04.2023).

14. Перечень вредных организмов карантинного значения для Республики Узбекистан / Россельхознадзор. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. URL: https://fsvps.gov.ru/sites/default/files/files/ehksport-import/uzbekistan/aktualnyy_perechen_vrednyh_organizmov_karantinnogo_znacheniya_dlya_respubliki_uzbekistan.pdf.

15. Перечень вредных организмов, ввоз и распространение которых в Республике Молдова запрещен / Россельхознадзор. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. URL: https://fsvps.gov.ru/sites/default/files/fsvps-docs/ru/importExport/moldova/files/entity_denied.pdf).

16. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 30 ноября 2016 г. N 158 «Об утверждении единого перечня карантинных объектов Евразийского экономического союза» (с изменениями и дополнениями). URL: https://base. garant.ru/71623912/.

17. Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 30 ноября 2016 г. N 157 «Об утверждении Единых карантинных фитосанитарных требований, предъявляемых к подкарантинной продукции и подкарантинным объектам на таможенной границе и на таможенной территории Евразийского экономического союза» (с изменениями и дополнениями). URL: (https://fsvps.gov.ru/files/reshenie-soveta-evrazijskoj-jekonomich-6/.

18. Baek K.Y., Lee H.H., Son G.J., Lee P.A., Roy N., Seo Y.S., Lee S.W. Specific and Sensitive Primers Developed by Comparative Genomics to Detect Bacterial Pathogens in Grains // The Plant Pathology Journal. 2018. Vol. 34(2). P. 104-112. doi: 10.5423/PPJ.OA.11.2017.0250.

19. EPPO. PM 7/76 (5) Use of EPPO diagnostic standards //EPPO Bulletin. – 2018. – Т. 48. – P. 373–377

20. Gupta P., Swarup G. Ear-cockle and yellow ear rot disease of wheat. II. Nematode bacterial association. Nemato- logia. 1972. Vol. 18. P. 320–324.

21. Ignatyeva I.M., Karimova E.V., Prikhodko S.I. Diagnostics of the bacterial blight pathogen of bean Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli in plant and seed material of grain legumes using molecular genetics methods // AIP Conference Proceedings: 4th International Conference on Modern Synthetic Methodologies for Creating Drugs and Functional Materials, MOSM 2020, Yekaterinburg, 16-20 November 2020. Vol. 2388, Issue 1. – American Institute of Physics Inc.: American Institute of Physics Inc. 2021. P. 030014. doi: 10.1063/5.0068504.

22. Murray T.D., Schroeder B.K., Schneider W.L., Luster D.G., Sechler A., Rogers E.E., Subbotin S.A. Rathayibacter toxicus, Other Rathayibacter Species Inducing Bacterial Head Blight of Grasses, and the Potential for Livestock Poisonings // Phytopathology. 2017.Vol. 107(7). P. 804-815. doi: 10.1094/PHYTO-02-17-0047-RVW.

23. Muvingi M., Slovareva O.Y., Ruberts V.S., Igonin V.N. Detection and identification of Rathayibacter tritici in Russian grain crop survey // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии: Сборник тезисов докладов 20-й Всероссийской конференции молодых учёных, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева, Москва, 27–29 октября 2020 года. – Москва: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии». 2020. P. 158–159. doi: 10.48397/ARRIAB.2020.20.095.

24. Park J., Lee P.A., Lee H.H., Choi K., Lee S.W., Seo Y.S. Comparative Genome Analysis of Rathayibacter tritici NCPPB 1953 with Rathayibacter toxicus Strains Can Facilitate Studies on Mechanisms of Nematode Association and Host Infection // The Plant Pathology Journal. 2017. Vol. 33(4). P. 370-381. doi: 10.5423/PPJ.OA.01.2017.0017.

25. Paruthi I. J., Mohinder Singh M. S., Gupta D. C. Quantitative and qualitative losses in wheat grains due to’earcockle’and’tundu’. – 1987.

26. Postnikova E., Agarkova I.V., Schneider W.L., Sechler A.J., Riley I.T. CHAPTER 15: Detection of Rathayibacter spp. in Seeds of Cereals and Grasses // Detection of Plant-Pathogenic Bacteria in Seed and Other Planting Material, Second Edition. – The American Phytopathological Society. 2017. P. 95–101.

27. PM 7/60 (2) Pantoea stewartii subsp. stewartii // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 2016. № 46(2). P. 226–236.

28. PM 7/98 (3) Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity // EPPO Bulletin. 2018. Vol. 48(3). P. 387–404. doi: 10.1111/epp.12508.

29. Reasoner D.J., Geldreich E.E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water // Applied and Environmental Microbiology. 1985. Vol. 49(1). P. 1-7. doi: 10.1128/aem.49.1.1-7.1985.

30. Sabet A.K. On the host range and systematic position of the bacteria responsible for the yellow slime diseases of wheat (Triticum vulgare Vill.) and cocksfoot grass (L. Dactylis glomerata) // Annals of Applied Biology. 1954. Vol. 41. P. 606–611.

31. Starodumova I.P., Dorofeeva L. V., Prisyazhnaya N.V., Tarlachkov S.V., Vasilenko O.V., Avtukh A.N., Ospennikov Y.V., Subbotin S.A., Evtushenko L.I. Rathayibacter tanaceti sp. nov., a Novel Actinobacterium from Tanacetum vulgare Infested by Foliar Nematode Aphelenchoides sp. // Current Microbiology. 2024. Vol. 81. P. 123. https://doi.org/10.1007/s00284-024-03643-7.

32. Zgurskaya H.I., Evtushenko L.I., Akimov V.N., Kalakoutskii L.V. Rathayibacter gen. nov., including the species Rathayibacter rathayi comb. nov., Rathayibacter tritici comb. nov., Rathayibacter iranicus comb. nov., and six strains from annual grasses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1993. Vol. 43. P. 143-149. doi: 10.1099/00207713-43-1-143.

33. BLAST. Basic Local Alignment Search Tool [Electronic resource]. – Access mode: https://blast. ncbi.nlm.nih.gov (date of access: 05.12.2024).

34. Rathayibacter tritici strain NCPPB 1953 chromosome, complete genome / NCBI. The National Center for Biotechnology Information. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1056838566 (дата обращения 01.11.2024).

35. Unipro UGENE software / URL: https://ugene.net/ru/download-all.html (last accessed: 04.01.2025).