Молекулярно-генетические методы, применяемые для детекции карантинных объектов. Инновации, вызовы и перспективы

Карантинные объекты представляют глобальную угрозу для сельского хозяйства, вызывая потери урожая до 30% ежегодно. В связи с климатическими изменениями и развитой международной торговлей, появлением новых крупных поставщиков семенного и посадочного материала, а также готовой продукции требуется своевременно реагировать на новые вызовы – совершенствовать существующие подходы и разрабатывать новые решения для обеспечения продовольственной безопасности, анализа фитосанитарных рисков максимально точными и быстрыми методами. Традиционные методы детекции, такие как микробиологический посев и серологические тесты, требуют значительных временных затрат (до 14 дней) и часто недостаточно специфичны. Молекулярно-генетические подходы, основанные на анализе ДНК/РНК, позволяют решить эти проблемы, обеспечивая раннее обнаружение патогенов до появления симптомов, дифференциацию штаммов на уровне генома, мониторинг резистентности к антибиотикам и пестицидам, возможность оценки эффективности средств защиты, обнаружение латентных патогенов при отсутствии внешних проявлений. Современные молекулярно-генетические технологии революционизируют диагностику карантинных организмов, бактерий, грибов, оомицетов и вирусов. В статье представлен анализ методов, включая метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), изотермическую амплификацию (LAMP), секвенирование нового поколения (NGS) и CRISPR-системы, с акцентом на их уникальные преимущества, существующие ограничения и практическое применение. Особое внимание уделено интеграции этих технологий в фитосанитарный мониторинг для предотвращения распространения карантинных и сельскохозяйственно значимых организмов. Практические результаты, получаемые с использованием молекулярно-генетических методов, демонстрируют, что комбинация методов значительно повышает точность диагностики, а развитие портативных платформ расширяет возможности полевых исследований.

1. Антонова О.С., Рудницкая Г.Е., Тупик А.Н., Буляница А.Л., Евстрапов А.А., Курочкин В.Е. «Полимеразная цепная реакция:. Приборная и методическая реализация. Обзор аналитических характеристик» // Научное приборостроение. 2011. 21 (4), 5–21.

2. Волков А.А., Долгова А.С., Дедков В.Г. «Молекулярные диагностические платформы, созданные на базе систем CRISPR-Cas» // Инфекция и иммунитет. 2022. 1, 9-20. URL: DOI: 1015789/2220-7619-ССВ1843.

3. Зубик А., Рудницкая Г.Е., Евстрапов А. «Метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) в формате микроустройства (обзор)» // НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ. 2021. 31(1):3-43. URL: DOI: 10.18358/np-31-1-i343

4. Назаров П. А., Балеев Д. Н., Иванова М. И., Соколова Л. М., Каракозова М. В. «Инфекционные болезни растений: этиология, современное состояние, проблемы и перспективы защиты Растений» // ACTA NATURAE. 2020. 12.3 (46). DOI: 10.32607/actanaturae.11026.

5. Колесников А.В., Козырь А.В., Шемякин И.Г. «Перспективы применения аптамеров в диагностике бактериальных инфекций // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012. 2б 1–6.

6. Лебедева Ю.Л., Черкашин Е.А., Акимкин В.Г. «СОВРЕМЕННЫЕ ПЛАТФОРМЫ ЦИФРОВОЙ ПЦР» // БИОТЕХНОЛОГИЯ, 2024, T. 40, № 1, СТР. 61-83. DOI: 10.56304/S023427582401006X.

7. Иванов А. В., Сафенкова И. В., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б. » Потенциальное использование анализов изотермической амплификации для полевой диагностики патогенов растений.» Растения (2021). 10 (11), 2424. doi: 10.3390/plants10112424.

8. Abdelfattah A., Malacrinò A., Wisniewski M., Cacciola S. O., Schena L. Metabarcoding: A powerful tool to investigate microbial communities and shape future plant protection strategies // Biol. Control. 2018. 120, 1–10. doi: 10.1016/j.biocontrol.2017.07.009.

9. Adams I. P., Glover R. H., Monger W. A., Mumford R., Jackeviciene E., Navalinskiene M., et al. Nextgeneration sequencing and metagenomic analysis: A universal diagnostic tool in plant virology // Mol. Plant Pathol. 2009. 10 (4), 537–545. doi: 10.1111/j.1364-3703.2009.00545.x.

10. Anne-Katrin Mahlein. Plant Disease Detection by Imaging Sensors – Parallels and Specific Demands for Precision Agriculture and Plant Phenotyping // Pland Disease. 2016. 241-251. https://doi.org/10.1094/PDIS-03-15-0340-FE.

11. Antonet M. Svircev, Won-Sik Kim, Susan M. Lehman, Alan Castle. Erwinia amylovora: Modern Methods for Detection and Differentiation // Methods in molecular biology Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2009. 508:115-29. doi: 10.1007/978-1-59745-062-1_10.

12. Ascoli C. A., Aggeler B. Overlooked benefits of using polyclonal antibodies // BioTechniques 2018. 65 (3), 127–136. doi: 10.2144/btn-2018-0065.

13. Barghouthi S. A. A universal method for the identification of bacteria based on general PCR primers // Indian J. Microbiol. 2011. 51 (4), 430–444. doi: 10.1007/s12088-011-0122-5.

14. Barsukova G.N., Sheudzhen Z.R., Derevenets D.K. Reduction of the area of agricultural and arable land as a global trend of reducing part of resource potential of agricaltural prodaction // International agricultural journal 2021. 6, 6-9. doi: 10.22412/2588-0209-2021-10413.

15. Becherer L., Borst N., Bakheit M., Frischmann S., Zengerle R., von Stetten F. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) – review and classification of methods for sequence-specific detection. Anal. Methods. 2020. 12 (6), 717–746. doi: 10.1039/C9AY02246E.

16. Bester R., Jooste A. E. C., Maree H. J., Burger J. T. Real-time RT-PCR high-resolution melting curve analysis and multiplex RT-PCR to detect and differentiate grapevine leafroll-associated virus 3 variant groups I, II, III and VI // Virol. J. 2012. 9 (1), 219. doi: 10.1186/1743-422X-9-219.

17. Beye M., Fahsi N., Raoult D., Fournier P.-E. Careful use of 16S rRNA gene sequence similarity values for the identification of mycobacterium species // New Microbes New Infect. 2017. 22, 24–29. doi: 10.1016/j.nmni.2017.12.009.

18. Bridle H., Desmulliez M. Chapter 7–biosensors for the detection of waterborne pathogens, in Waterborne pathogens. 2021. 2nd ed. Ed. Bridle, H. (Academic Press), 189–235. doi: 10.1016/B978-0-444-64319-3.00007-1.

19. Buja I., Sabella E., Monteduro A. G., Chiriacò M. S., De Bellis L., Luvisi A., et al. Advances in plant disease detection and monitoring: From traditional assays to infield diagnostics // Sensors. 2021. 21 (6). doi: 10.3390/s21062129.

20. Bush A., Compson Z. G., Monk W. A., Porter T. M., Steeves R., Emilson E., et al. Studying ecosystems with DNA metabarcoding: Lessons from biomonitoring of aquatic macroinvertebrates // Front. Ecol. Evol. 2019. 7. doi: 10.3389/fevo.2019.00434

21. Chen B., Jiang Y., Cao X., Liu C., Zhang N., Shi D. Droplet digital PCR as an emerging tool in detecting pathogens nucleic acids in infectious diseases. // Clinica Chimica Acta. 2021. 517, 156–161. doi: 10.1016/j.cca.2021.02.008.

22. Craw P., Balachandran W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: A critical review. Lab // Chip. 2021. 12 (14), 2469. doi: 10.1039/c2lc40100b.

23. Doudna J. A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 // Science. 2014. 346 (6213), 1258096. doi: 10.1126/science.1258096.

24. Duan Y., Zhou L., Hall D. G., Li W., Doddapaneni H., Lin H., et al. Complete genome sequence of citrus huanglongbing bacterium, ‘Candidatus liberibacter asiaticus’ obtained through metagenomics // Mol. Plant-Microbe Interactions®. 2009. 22 (8), 1011–1020. doi: 10.1094/MPMI-22-8-1011.

25. FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges // Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2017. p11–16.

26. FAO. New standards to curb the global spread of plant pests and diseases. 2019. Available at: https://www.fao.org/news/story/en/item/1187738/icode/.

27. Ferone M., Gowen A., Fanning S., Scannell A. G. M. Microbial detection and identification methods: Bench top assays to omics approaches // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2020. 19 (6), 3106–3129. doi: 10.1111/1541-4337.12618.

28. Fang and Ramasamy. Current and prospective methods for plant disease detection // Biosensors. 2015. 5, 537–561. doi: 10.3390/bios5030537.

29. Hameed S., Xie L., Ying Y. Conventional and emerging detection techniques for pathogenic bacteria in food science: A review // Trends Food Sci. Technol. 2018. 81, 61–73. doi: 10.1016/j.tifs.2018.05.020.

30. Hayden R. T., Gu Z., Ingersoll J., Abdul-Ali D., Shi L., Pounds S., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. J. Clin. // Microbiol. 2013. 51 (2), 540–546. doi: 10.1128/JCM.02620-12.

31. Hindson B. J., Ness K. D., Masquelier D. A., Belgrader P., Heredia N. J., Makarewicz A. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number // Anal. Chem. 2011. 83 (22), 8604–8610. doi: 10.1021/ac202028g

32. Hoshino T., Inagaki F. Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR. Syst. Appl // Microbiol. 2012. 35 (6), 390–395. doi: 10.1016/j.syapm.2012.06.006.

33. Hugerth L. W., Andersson A. F. Analysing microbial community composition through amplicon sequencing: From sampling to hypothesis testing // Front. Microbiol. 2017. 8. doi: 10.3389/fmicb.2017.01561.

34. Ivanov A. V., Safenkova I. V., Zherdev A. V., Dzantiev B. B. The potential use of isothermal amplification assays for in-field diagnostics of plant pathogens // Plants. 2021. 10 (11), 2424. doi: 10.3390/plants10112424.

35. Kaminski M. M., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Zhang F., Collins J. J. CRISPR-based diagnostics // Nat. Biomed. Eng. 2021. 5 (7). doi: 10.1038/s41551-021-00760-7.

36. Kohn B. LISTERIA detection by commercial immunomagnetic particle-based assays // Encyclopedia of food microbiology. Ed. Robinson, R. K. (Elsevier). 1999. 1222–1228. doi: 10.1006/rwfm.1999.0960.

37. Kralik P., Ricchi M. A basic guide to real time PCR in microbial diagnostics: Definitions, parameters, and everything // Front. Microbiol. 2017. 8. doi: 10.3389/fmicb.2017.00108.

38. Lau H. Y., Botella J. R. Advanced DNA-based point-of-Care diagnostic methods for plant diseases detection // Front. Plant Sci. 2017. 8. doi: 10.3389/fpls.2017.02016

39. Li J., Macdonald J., Von S. F. Review: A comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification // Analyst. 2018. 144 (1), 31–67. doi: 10.1039/C8AN01621F.

40. Lievens and Thomma. Recent developments in pathogen detection arrays: Implications for fungal plant pathogens // European Journal of Plant Pathology. 2005. 113, 75–89. doi: 10.1007/s10658-005-0425-5.

41. Virol. Methods. 2014.204, 105–108. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.02.031.

42. Liu H. Y., Hopping G. C., Vaidyanathan U., Ronquillo Y. C., Hoopes P. C., Moshirfar M. Polymerase chain reaction and its application in the diagnosis of infectious keratitis // Med. Hypothesis Discovery Innovation Ophthalmol. 2019. 8 (3), 152–155.

43. Liu J., Li C., Muhae-Ud-Din G., Liu T., Chen W., Zhang J., et al. Development of the Droplet Digital PCR to Detect the Teliospores of Tilletia controversa Kühn in the Soil With Greatly Enhanced Sensitivity // Front. Microbiol. 2020. 11, 4. doi: 10.3389/fmicb.2020.00004.

44. Lobato I. M., O’Sullivan C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. TrAC // Trends Anal. Chem. 2018. 98, 19–35. doi: 10.1016/j.trac.2017.10.015.

45. Loit K., Adamson K., Bahram M., Puusepp R., Anslan S., Kiiker R., et al. Relative performance of MinION (Oxford nanopore technologies) versus sequel (Pacific biosciences) third-generation sequencing instruments in identification of agricultural and forest fungal pathogens // Appl. Environ. Microbiol. 2019. 85 (21), e01368–e01319. doi: 10.1128/AEM.01368-19.

46. López M. M., Bertolini E., Olmos A., Caruso P., Gorri, M. T., Llop P., et al. Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bacteria // Int. Microbiol. 2003. 6 (4), 233–243. doi: 10.1007/s10123-003-0143-y.

47. López M., Llop P., Olmos A., Marco-Noales E., Cambra M., Bertolini E. Are molecular tools solving the challenges posed by detection of plant pathogenic bacteria and viruses? // Curr. Issues Mol. Biol. 2009. 11, 13–46. doi: 10.21775/cimb.011.013.

48. Mandal et al. Recent advances in molecular diagnostics of fungal plant pathogens: A mini-review // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2011. 27, 1773–1780. doi: 10.1007/s11274-010-0636-8.

49. Marc Venbrux ,Sam Crauwels, Hans Rediers Current and emerging trends in techniques for plant pathogen detection Front Plant Sci. 2023 May 8;14:1120968. doi: 10.3389/fpls.2023.1120968

50. Martinelli et al.Advanced methods of plant disease detection. A review // Agronomy for Sustainable Development. 2015. 35, 1–25, doi: 10.1007/s13593-014-0246-1.

51. Maurer J. J. Rapid detection and limitations of molecular techniques // Annu. Rev. Food Sci. Technol. 2011. 2 (1), 259–279. doi: 10.1146/annurev.food.080708.100730.

52. Mehetre G. T., Leo V. V., Singh G., Sorokan A., Maksimov I., Yadav M. K., et al. Current developments and challenges in plant viral diagnostics: A systematic review // Viruses. 2021. 13 (3), 412. doi: 10.3390/v13030412.

53. Mirmajlessi S. M., Loit E., Mänd M., Mansouripour S. M. Real-time PCR applied to study on plant pathogens: potential applications in diagnosis – a review // Plant protection Sciense. 2015. 15, 177–190. doi: 10.17221/104/2014-PPS.

54. Mori Y., Nagamine K., Tomita N., Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 289 (1), 150–154. doi: 10.1006/bbrc.2001.5921.

55. Narayanasamy P. // Microbial plant pathogens-detection and disease diagnosis (Springer Netherlands), 2011. pp 5–199. doi: 10.1007/978-90-481-9735-4.

56. Nikitinskaya E., Nikitinskiy D., Ivanova E., Ignatov A. Detection of viral infection using new generation sequencing technology in poultry farms of the Russian Federation // Veterinariya, Zootekhniya i Biotekhnologiya. 2024.10. doi: 10.36871/vet.zoo.bio.202410014

57. Piepenburg O., Williams C. H., Stemple D. L., Armes N. A. DNA Detection using recombination proteins // PloS Biol. 2006. 4 (7), e204. doi: 10.1371/journal.pbio.0040204.

58. Piombo E., Abdelfattah A., Droby S., Wisniewski M., Spadaro D., Schena L. Metagenomics approaches for the detection and surveillance of emerging and recurrent plant pathogens // Microorganisms. 2021. 9 (1). doi: 10.3390/microorganisms9010188.

59. Postollec F., Falentin H., Pavan S., Combrisson J., Sohier D. Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology // Food Microbiol. 2011. 28 (5), 848–861. doi: 10.1016/j.fm.2011.02.008.

60. Quince C., Walker A. W., Simpson J. T., Loman N. J., Segata N. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis // Nat. Biotechnol. 2017. 35 (9). doi: 10.1038/nbt.3935.

61. Rajagopal A., Yurk D., Shin C., Menge K., Jacky L., Fraser S., et al. Significant expansion of realtime PCR multiplexing with traditional chemistries using amplitude modulation // Sci. Rep. 2019. 9 (1). doi: 10.1038/s41598-018-37732-y.

62. Reller L. B., Weinstein M. P., Petti C. A. Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing // Clin. Infect. Dis. 2007. 44 (8), 1108–1114. doi: 10.1086/512818.

63. Riley M., Williamson M., Maloy O. Plant disease diagnosis // Plant Health Instructor. 2002. doi: 10.1094/PHI-I-2002-1021-01.

64. Roossinck M. J., Martin D. P., Roumagnac P. Plant virus metagenomics: Advances in virus discovery // Phytopathology®. 2015. 105 (6), 716–727. doi: 10.1094/PHYTO-12-14-0356-RVW.

65. Schaad N. W., Frederick R. D., Shaw J., Schneider W. L., Hickson R., Petrillo M. D., et al. Advances in molecular-based diagnostics in meeting crop biosecurity and phytosanitary issues // Annu. Rev. Phytopathol. 2003. 41 (1), 305–324. doi: 10.1146/annurev.phyto.41.052002.095435.

66. Sharpton T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data // Front. Plant Sci. 2014. 5. doi: 10.3389/fpls.2014.00209.

67. Shen C.-H. “Chapter 9–amplification of nucleic acids,” in Diagnostic molecular biology. Ed. Shen C.-H. (Academic Press). 2019. 215–247. doi: 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2.

68. Simon G. Edwards, John O’Callaghan, Alan D.W.Dobson. PCR-based detection and quantification of mycotoxigenic fungi // Mycological Research. 2002. 106 (9), Pages 1005-1025. doi: 10.1017/S0953756202006354

69. Singh A., Jones S., Ganapathysubramanian B., Sarkar S., Mueller D., Sandhu K., et al. Challenges and opportunities in machine-augmented plant stress phenotyping. // Trends Plant Sci. 2021. 26 (1), 53–69. doi: 10.1016/j.tplants.2020.07.010.

70. Slovareva O., Desyaterik A., Domoratskaya D. PCR IDENTIFICATION PSEUDOMONAS FUSCOVAGINAE, A PATHOGEN OF CEREAL CROPS // Risovodstvo. 2024. 23, 1(62), 27-35. doi: 10.33775/1684-2464-2024-62-1-27-35

71. Tanner F., Tonn S., de Wit J., Van den Ackerveken G., Berger B., Plett D. Sensor-based phenotyping of above-ground plant-pathogen interactions // Plant Methods. 2022. 18 (1), 35. doi: 10.1186/s13007-022-00853-7.

72. Taylor S. C., Laperriere G., Germain H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data // Sci. Rep. 2017. 7 (1). doi: 10.1038/s41598-017-02217-x.

73. Tewari D., Cieply S., Livengood J.Identification of bacteria recovered from animals using the 16S ribosomal RNA gene with pyrosequencing and Sanger sequencin //. J. Vet. Diagn. Invest. 2011. 23 (6), 1104–1108. doi: 10.1177/1040638711425583.

74. Thies J. Chapter 6 – Molecular Approaches to Studying the Soil Biota. In Eldor Paul A. Ed // Soil Microbiology, Ecology and Biochemistry (Fourth Edition). (Academic Press). 2015 . 151–185. doi: 10.1016/B978-0-12-415955-6.00006-2.

75. Toh S. Y., Citartan M., Gopinath S. C. B., Tang T.-H. Aptamers as a replacement for antibodies in enzyme-linked immunosorbent assay // Biosensors Bioelectron. 2015. 64, 392–403. doi: 10.1016/j.bios.2014.09.026.

76. Välimaa A.-L., Tilsala-Timisjärvi A., Virtanen E. Rapid detection and identification methods for listeria monocytogenes in the food chain – a review // Food Control 2015. 55, 103–114. doi: 10.1016/j.foodcont.2015.02.037.

77. Wang X., Shang X., Huang X. Next-generation pathogen diagnosis with CRISPR/Cas-based detection methods // Emerging Microbes Infect. 2020. 9 (1), 1682–1691. doi: 10.1080/22221751.2020.1793689.

78. Ward E., Foster S. J., Fraaije B. A., Mccartney H. A. Plant pathogen diagnostics: Immunological and nucleic acid-based approaches // Ann. Appl. Biol. 2004. 145 (1), 1–16. doi: 10.1111/j.1744-7348.2004.tb00354.x.

79. Zhao X., Lin C.-W., Wang J., Oh D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens // J. Microbiol. Biotechnol. 2014. 24 (3), 297–312. doi: 10.4014/jmb.1310.10013.

80. Zhao Y., Xia Q., Yin Y., Wang Z. Comparison of droplet digital PCR and quantitative PCR assays for quantitative detection of xanthomonas citri subsp. Citri // PloS One. 2016. 11 (7), e0159004. doi: 10.1371/journal.pone.0159004.

81. Zubler and Yoon. Proximal Methods for Plant Disease Detection Using Hyperspectral Imaging // Mol Remote Sensing. 2020. 12, 3539. doi: 10.3390/rs12213539.