phytosanitaryФитосанитария. Карантин растенийPlant Health and Quarantine2782-327X10.69536/j3225-4992-5329-tphytosanitary-95Research ArticleНАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯSCIENTIFIC RESEARCHВалидация ПЦР-тестов с наборами российского производства для выявления Ralstonia solanacearum sensu lato в растительных экстрактахValidation of PCR tests with Russian kits for the detection of Ralstonia solanacearum sensu lato in plant extractshttps://orcid.org/0000-0003-4020-2910ДреноваН. В.DrenovaN. V.

Дренова Наталия Васильевна, старший научный сотрудник научно-методического отдела вирусологии и бактериологии ФГБУ «ВНИИКР»,

р. п. Быково, г. Раменское, Московская обл

Nataliya Drenova, Senior Researcher, Research and Methodology Department of Virology and Bacteriology, FGBU “VNIIKR”

Bykovo, Ramenskoye, Moscow Oblast

drenova@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1047-0105ИгнатьеваИ. М.IgnatievaI. M.

Игнатьева Ирина Михайловна, научный сотрудник лаборатории бактериологии и анализа ГМО ФГБУ «ВНИИКР»

р. п. Быково, г. Раменское, Московская обл

Irina Ignatieva, Researcher, Bacteriology and GMO Analysis Laboratory, FGBU “VNIIKR”

Bykovo, Ramenskoye, Moscow Oblast

babiraignirmi@yandex.ruКондратьевМ. О.KondratievM. O.

Кондратьев Максим Олегович, агроном научно-методического отдела вирусологии и бактериологии ФГБУ «ВНИИКР»

р. п. Быково, г. Раменское, Московская обл

Maksim Kondratiev, Agronomist, Research and Methodology Department of Virology and Bacteriology, FGBU “VNIIKR”

Bykovo, Ramenskoye, Moscow Oblast

affut24@rambler.ruШнейдерЕ. Ю.ShneyderYe. Yu.

Шнейдер Елена Юрьевна, старший научный сотрудник научно-методического отдела вирусологии и бактериологии ФГБУ «ВНИИКР»

р. п. Быково, г. Раменское, Московская обл

Elena Shneyder, Senior Researcher, Research and Methodology Department of Virology and Bacteriology, FGBU “VNIIKR”

Bykovo, Ramenskoye, Moscow Oblast

seunch@mail.ruФГБУ «Всероссийский центр карантина растений»РоссияFGBU “All-Russian Plant Quarantine Center” (FGBU “VNIIKR”)Russian Federation20222503202201220Copyright © Дренова Н.В., Игнатьева И.М., Кондратьев М.О., Шнейдер Е.Ю., 20222022Дренова Н.В., Игнатьева И.М., Кондратьев М.О., Шнейдер Е.Ю.Drenova N.V., Ignatieva I.M., Kondratiev M.O., Shneyder Y.Y.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://phytosanitary.vniikr.ru/jour/article/view/95

Проведена оценка применимости (валидация) двух тестов на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени и теста в формате FLASH c коммерческими наборами для выделения ДНК и для амплификации производства российских компаний ООО «АгроДиагностика» и ООО «Синтол», а также с использованием отечественных амплификаторов для выявления генетического материала комплекса возбудителей карантинного заболевания бурой бактериальной гнили картофеля Ralsto­ nia solanacearum sensu lato в растительном экстракте картофеля и роз. Аналитическая чувствительность тестов для большинства штаммов составила 102–103 КОЕ/мл. Повторяемость и воспроизводимость тестов на основе ПЦР в реальном времени зависели от используемого прибора. Значения рабочих критериев до 100% получены на детектирующем амплификаторе «ДТ-лайт» производства компании ООО «ДНК-Технология». На основании результатов испытаний наборы ООО «Агро-Диагностика» могут быть рекомендованы для проведения универсальных отборочных тестов при выполнении лабораторных исследований образцов подкарантинной продукции на выявление возбудителей видового комплекса. Тест с набором ООО «Синтол», специфичный к R. solanacearum расы 3 биовара 2, может быть использован для подтверждения положительного результата отборочного теста или в качестве отборочного при исследовании образцов из зон распространения R. solanacearum расы 3 биовара 2, а также для дифференциальной диагностики этой группы.

The validation of two tests based on qPCR and a FLASH test with commercial kits for DNA isolation and amplification produced by Russian companies AgroDiagnostika and Syntol was assessed, as well as using Russian amplifiers for identification of the genetic material of a complex of causative agents of the quarantine disease, brown rot and bacterial wilt Ralstonia solanacearum sen­ su lato, in extract of potatoes and roses. The analytical sensitivity of tests for most strains was 102–103 CFU/ml. The repeatability and reproducibility of RT-PCR tests depended on the instrument used. The values of the working criteria up to 100% were obtained on a qPCR machine DT-light manufactured by DNA-Technology. Based on the test results, Agro-Diagnostika kits can be recommended for carrying out universal screening tests during laboratory studies of regulated products samples to identify pathogens of the species complex. The test with the Syntol kit, specific to R. solanacearum race 3 biovar 2, can be used to confirm a positive result of the screening test or as a screening test when examining samples from the spread areas of R. solanacearum race 3 biovar 2, as well as for differential diagnosis this group.

картофельрозабурая гниль картофелядиагностикавалидациякарантин.potatoesrosebrown potato rot diagnosticsvalidationquarantineReferencesДренова Н., 2019. Ожог плодовых культур в Российской Федерации и современные подходы к его диагностике. – Плодоводство и ягодоводство России, № 58: 131–137.Drenova N. Fire blight in the Russian Federation and current approaches to its diagnostics [Ozhog plodovykh kultur v Rossiyskoy Federatsii i sovremennyye podkhody k yego diagnostike]. Pomiculture and small fruits culture in Russia, 2019; 58: 131–137 (in Russian).Дренова Н., Кузнецова А., 2012. Валидация метода FLASH-ПЦР для выявления возбудителя бурой бактериальной гнили картофеля Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. в картофельном экстракте. – ФГБУ «ВНИИКР», Быково, 28 с.Drenova N., Kuznetsova A. Validation of the FLASH-PCR method for detecting the causative agent of brown bacterial rot of potatoes Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. in potato extract [Validatsiya metoda FLASH-PCR dlya vyyavleniya vozbuditelya buroy bakterialnoy gnili kartofelya Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. v kartofelnom ekstrakte]. FGBU “VNIIKR”, Bykovo, 2012, 28 p. (in Russian).Ерохова М., 2020. Новая классификация бактерии Ralstonia solanacearum – возбудителя бурой гнили картофеля. – Защита и карантин растений, № 12: 6.Yerokhova M. New classification of the bacterium Ralstonia solanacearum – the causal agent of potato brown rot [Novaya klassifikatsiya bakterii Ralstonia so­ lanacearum – vozbuditelya buroy gnili kartofelya]. Plant Protection and Quarantine, 2020; 12: 6 (in Russian).Завриев С., Рязанцев Д., Кошкина Т., 2007. Эффективный экономический метод чувствительной диагностики и идентификации патогенов картофеля. – Картофелеводство России: актуальные проблемы науки и практики: материалы международного конгресса «Картофель. Россия – 2007», М.: 100–103. ISBN 978-5-7367-0643-3.Zavriev S., Ryazantsev D., Koshkina T. An efficient diagnostic method for the identification of potato viral pathogens [Effektivniy ekonomicheskiy metod chuvstvitelnoy diagnostiki i identifi tsii patogenov kartofelya]. Potato growing in Russia: topical problems of science and practice: materials of the international congress “Potatoes. Russia – 2007”, M. 2007; 100–103. ISBN 978-5-7367-0643-3 (in Russian).Корнев К., Копина М., 2012. Отчет о проведении лабораторных испытаний набора реагентов «Ralstonia solanacearum-РВ» для выявления возбудителя бурой гнили картофеля Ralstonia solanacearum раса 3 bv. 2 методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). – Быково, 18 с.Kornev K., Kopina M. Report on laboratory tests of the “Ralstonia solanacearum-RT” reagent kit to identify the causative agent of potato brown rot Ralsto­ nia solanacearum race 3 bv. 2 by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) [Otchet o provedenii laboratornykh ispytaniy nabora reagentov «Ralstonia sola­ nacearum-RV» dlya vyyavleniya vozbuditelya buroy gnili kartofelya Ralstonia solanacearum rasa 3 bv. 2 metodom polimeraznoy tsepnoy reaktsii v real’nom vremeni]. Bykovo, 2012; 18 p. (in Russian).Ребриков Д., Саматов Г., Трофимов Д. и др. ПЦР в реальном времени. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009, 223 с. ISBN 978-5-9963-0086-0.Rebrikov D., Samatov G., Trofimov D. et al. Real time PCR [PCR v realnom vremeni]. M., BINOM, Laboratoriya znaniy, 2009; 223 p. ISBN 978-5-9963-0086-0 (in Russian).Егоров Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. – М.: МГУ, 1995, 224 с.Egorov N. Guide to practical training in microbiology: Textbook. 3rd ed., Rev. and additional. M., MSU, 1995; 224 p. (in Russian).Стандарт ISO/IEC 17025:2017 «Общие требования к компетенции испытательных и калибровочных лабораторий».Standard ISO/IEC 17025:2017 “General requirements for the competence of testing and calibration laboratories” (in Russian).СТО ВНИИКР 4.009-2013 «Возбудитель бурой бактериальной гнили картофеля Ralstonia sola­ nacearum (Smith) Yabuuchi et al. Методы выявления и идентификации».STO VNIIKR 4.009-2013 “The causative agent of brown bacterial rot of potatoes Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Detection and identification methods” (in Russian).Шнейдер Е., Дренова Н., Каримова Е., 2021. Карантинные для Российской Федерации бактериозы видов Ralstonia. – Фитосанитария. Карантин растений, 7 (3): 10–26.Shneyder E., Drenova N., Karimova E. Ralsto­ nia spp. bacterioses quarantine for the Russian Federation. Plant Health and Quarantine, 2021; 7 (3): 10–26.Buddenhagen I., Sequeira L. & Kelman A., 1962. Designation of rases of Pseudomonas sola­ nacearum. – Phytopathology, 52: 726.Buddenhagen I., Sequeira L. & Kelman A. Designation of rases of Pseudomonas solanacearum. Phyto­ pathology, 1962; 52: 726.EPPO, 2004. PM 7/21 (1): Ralstonia sola­ nacearum. Diagnostic protocols for regulated pests. – EPPO Bulletin, 34: 173–178.EPPO. PM 7/21 (1): Ralstonia solanacearum. Diagnostic protocols for regulated pests. EPPO Bulletin, 2004; 34: 173–178.EPPO, 2018. PM 7/21 (2): Ralstonia sola­ nacearum, R. pseudosolanacearum and R. syzygii (Ralstonia solanacearum species complex). – EPPO Bulletin, 48 (1): 32–63.EPPO. PM 7/21 (2): Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum and R. syzygii (Ralstonia solanacearum species complex). 2018; EPPO Bulletin, 48 (1): 32–63.EPPO, 2019. PM 7/98 (4): Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity. – EPPO Bulletin, 49 (3): 530–563.EPPO. PM 7/98 (4): Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity. 2019; EPPO Bulletin, 49 (3): 530–563.Fegan M. & Prior P., 2005. How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. – American Phytopathological Society, St Paul, MN (US): 449–461.Fegan M. & Prior P. How complex is the “Ralsto­ nia solanacearum species complex”. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. American Phytopathological Society, St Paul, MN (US), 2005; 449–461.Horita M., Tsuchiya K., Suga Y., Yano K., Waki T., Kurose D., Furuya N., 2014. Current classification of Ralstonia solanacearum and genetic diversity of the strains in Japan. – Journal of general plant pathology, 80 (6): 455–465.Horita M., Tsuchiya K., Suga Y., Yano K., Waki T., Kurose D., Furuya N. Current classifi ation of Ralstonia solanacearum and genetic diversity of the strains in Japan. Journal of general plant pathology, 2014; 80 (6): 455–465.Lenarčič R., Morisset D., Pirc M., Llop P., Ravnikar M., Dreo T., 2014. Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia so­ lanacearum. – PLoS ONE, 9 (4), e96027. URL: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0096027.Lenarčič R., Morisset D., Pirc M., Llop P., Ravnikar M., Dreo T. Loop-mediated isothermal amplifi ation of specifi endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia sola­ nacearum. PLoS ONE, 2014; 9 (4), e96027. URL: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.Lin C., Chuang M., Wang J., 2015. First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum on chard in Taiwan. – Plant Disease, 99 (2): 282.Lin C., Chuang M., Wang J. First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum on chard in Taiwan. Plant Disease, 2015; 99 (2): 282.Norman D., Bocsanczy A., Harmon P., Harmon C., Khan A., 2018. First report of bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum on blueberries (Vaccinium corymbosum) in Florida. – Plant Disease, 102 (2): 438.Norman D., Bocsanczy A., Harmon P., Harmon C., Khan A. First report of bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum on blueberries (Vac­ cinium corymbosum) in Florida. Plant Disease, 2018; 102 (2): 438.Safni I., Cleenwerck I., De Vos P., Fegan M., Sly L., Kappler U., 2014. Polyphasic taxonomic revision of the Ralstonia solanacearum species complex: proposal to emend the descriptions of Ralstonia solanacearum and Ralstonia syzygii and reclassify current R. syzygii strains as Ralstonia syzygii subsp. syzygii subsp. nov., R. solanacearum phylotype IV strains as Ralstonia syzygii subsp. indonesiensis subsp. nov., banana blood disease bacterium strains as Ralstonia syzygii subsp. celebesen­ sis subsp. nov. and R. solanacearum phylotype I and III strains as Ralstonia pseudosolanacearum sp. nov. – Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 64: 3087–3103. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.066712-0.Safni I., Cleenwerck I., De Vos P., Fegan M., Sly L., Kappler U. Polyphasic taxonomic revision of the Ralstonia solanacearum of the Ralstonia solanacearum species complex: proposal to emend the descriptions of Ralstonia solanacearum and Ralstonia syzygii and reclassify current R. syzygii strains as Ralstonia syzygii subsp. syzygii subsp. nov., R. solanacearum phylotype IV strains as Ralstonia syzygii subsp. indonesiensis subsp. nov., banana blood disease bacterium strains as Ralstonia syzygii subsp. celebesen­ sis subsp. nov. and R. solanacearum phylotype I and III strains as Ralstonia pseudosolanacearum sp. nov. – Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 64: 3087–3103. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.066712-0.She X., He Z., Li H., 2018. Genetic structure and phylogenetic relationships of Ralstonia solanacearum strains from diverse origins in Guangdong Province, China. – Journal of Phytopathology, 166 (3): 177–186.She X., He Z., Li H., 2018. Genetic structure and phylogenetic relationships of Ralstonia solanacearum strains from diverse origins in Guangdong Province, China. – Journal of Phytopathology, 166 (3): 177–186.Tjou-Tam-Sin N., van de Bilt J., Westenberg M., Bergsma-Vlami M., Korpershoek H., Vermunt A., Meekes E., Teunissen H., Van Vaerenbergh J., 2017. First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum in ornamental Rosa sp. – Plant Disease, 201 (2), 378 p.Tjou-Tam-Sin N., van de Bilt J., Westenberg M., Bergsma-Vlami M., Korpershoek H., Vermunt A., Meekes E., Teunissen H., Van Vaerenbergh J., 2017. First report of bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum in ornamental Rosa sp. – Plant Disease, 201 (2), 378 p.Wicker E., Grassart L., Coranson-Beaudu R., Mian D., Guilbaud C., Fegan M., Prior P., 2007. Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. – Applied and Environmental Microbiology, 73 (21): 6790–801. URL: https://doi.org/10.1128/AEM.00841-07.Wicker E., Grassart L., Coranson-Beaudu R., Mian D., Guilbaud C., Fegan M., Prior P., 2007. Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. – Applied and Environmental Microbiology, 73 (21): 6790–801. URL: https://doi.org/10.1128/AEM.00841-07.О потенциальных рисках, связанных с ввозом в страну бананов. Официальный сайт Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор). – URL: https://fsvps.gov.ru/fsvps/print/news/16317.html (дата обращения: 10.09.2021).About the potential risks associated with the import of bananas into the country. Official website of the Federal Service for Veterinary and hytosanitary Surveillance (Rosselkhoznadzor). URL: https://fsvps.gov.ru/fsvps/print/news/16317.html (last accessed: 10.09.2021).EPPO Global Database. – URL: https://gd.eppo.int (дата обращения: 30.09.2021).EPPO Global Database. URL: https://gd.eppo.int (last accessed: 30.09.2021).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.