phytosanitaryФитосанитария. Карантин растенийPlant Health and Quarantine2782-327X10.69536/t5481-2640-1422-qphytosanitary-110Research ArticleДИАГНОСТИКАDIAGNOSTICSИсследование праймеров для диагностики фитоплазм из группы Apple proliferationStudy of primers for the diagnosis of phytoplasmas from the Apple proliferation grouphttps://orcid.org/0000-0001-9014-4179БашкироваИ. Г.BashkirovaI. G.

Башкирова Ида Геннадьевна, младший научный сотрудник – и. о. начальника научно-методического отдела вирусологии и бактериологии; аспирант

р. п. Быково, г. Раменское, Московская обл.

Ida Bashkirova, Junior Researcher, Acting Head of Research and Methodology Department of Virology and Bacteriology; postgraduate student

Bykovo, Ramenskoye, Moscow Oblast

Moscow

bashkirovaid@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6474-8913КаримоваЕ. В.KarimovaE. V.

Каримова Елена Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник – начальник научно- методического отдела вирусологии и бактериологии

р. п. Быково, г. Раменское, Московская обл.

Elena Karimova, PhD in Biology, Senior Researcher, Head of Research and Methodology Department of Virology and Bacteriology

Bykovo, Ramenskoye, Moscow Oblast

elenavkar@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3584-9130СмирноваИ. П.SmirnovaI. P.

Смирнова Ирина Павловна, доктор биологических наук, заслуженный профессор

г. Москва

Irina Smirnova, Advanced Doctor in Biology, Honored Professor

Moscow

smir-ip@yandex.ruФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»); ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (ФГАОУ ВО «РУДН»)РоссияFGBU “All-Russian Plant Quarantine Center” (FGBU “VNIIKR”); Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education “Peoples’ Friendship University of Russia” (FGAOU VO “RUDN University”)Russian FederationФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»)РоссияFGBU “All-Russian Plant Quarantine Center” (FGBU “VNIIKR”)Russian FederationФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (ФГАОУ ВО «РУДН»)РоссияFederal State Autonomous Educational Institution of Higher Education “Peoples’ Friendship University of Russia” (FGAOU VO “RUDN University”)Russian Federation202225082022032636Copyright © Башкирова И.Г., Каримова Е.В., Смирнова И.П., 20222022Башкирова И.Г., Каримова Е.В., Смирнова И.П.Bashkirova I.G., Karimova E.V., Smirnova I.P.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://phytosanitary.vniikr.ru/jour/article/view/110

Одними из наиболее опасных вредных организмов для растений являются фитоплазмы. Фитопатоге­ны из группы Apple proliferation (16SrX) вызывают фитоплазмозы у семечковых и косточковых куль­тур, которые приводят к огромным потерям пло­дово-ягодной продукции по всему миру. В группу 16SrX входят, в частности, такие некультивируе­мые бактерии: Candidatus Phytoplasma mali, которая вызывает болезнь пролиферации яблони (Apple proliferation); Candidatus Phytoplasma pyri, которая вызывает болезнь истощения груши (Pear decline); Candidatus Phytoplasma prunorum, вызывающая ев­ропейскую желтуху косточковых (European stone fruit yellows). Первые два вида включены в Единый перечень карантинных объектов Евразийского эко­номического союза (ЕАЭС). Несмотря на то что эти фитоплазмы входят в одну группу, им присущи разные естественные растения-хозяева, насекомые-переносчики, а также различный набор харак­терных симптомов у инфицированных растений. В статье приведены данные по изучению аналити­ческих характеристик (специфичность и чувстви­тельность) специфичных праймеров для выявле­ния фитопатогенных микроорганизмов из группы Apple proliferation методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и для последующей видовой идентификации возбудите­ля заболевания пролиферации яблони Candidatus Phytoplasma mali с использованием специфичных праймеров методом классической ПЦР. В ходе экс­периментов получены качественные специфичные продукты амплификации. Установлено, что с по­мощью исследуемой пары праймеров для класси­ческой ПЦР возможно диагностировать и идентифицировать возбудителя пролиферации яблони в зараженном растительном материале. В работе осуществлен анализ исследуемых специфичных праймеров с использованием онлайн-сервиса NCBI Primer-BLAST. Для проведения исследований ис­пользовали коллекцию ДНК фитоплазм из различ­ных групп: Apple proliferation, Stolbur, Foxtail palm yellow decline, Peanut witches’ broom, Elm yellows.

One of the most dangerous pests for plants are phy­toplasmas. Phytopathogens from the Apple prolifera­tion group (16SrX) cause phytoplasmoses in pome and stone fruit crops, which lead to huge losses of fruit and berry products around the world. The 16SrX group in­cludes, in particular, such uncultivated bacteria as: Candidatus Phytoplasma mali, causing apple proliferation; Candidatus Phytoplasma pyri, resulting in pear decline; Candidatus Phytoplasma prunorum, leading to European stone fruit yellows. The first two species are included in the Common List of Quarantine Pests of the Eurasian Economic Union (EAEU). Although they be­long to the same group, these phytoplasmas have dif­ferent natural hosts, insect vectors, and a different set of characteristic symptoms in infected plants. The arti­cle presents data on the study of the analytical charac­teristics (specificity and sensitivity) of specific primers for the detection of phytopathogenic microorganisms from the Apple proliferation group by real-time poly­merase chain reaction (PCR) and for subsequent spe­cies identification of the causative agent of apple pro­liferation Candidatus Phytoplasma mali using specific primers classical PCR method. During the experiments, high-quality specific amplification products were ob­tained. It has been established that using the studied pair of primers for classical PCR, it is possible to diag­nose and identify the causative agent of apple proliferation in infected plant material. In this work, the analy­sis of the studied specific primers was carried out using the NCBI Primer-BLAST online service. For research, we used a collection of phytoplasma DNA from various groups: Apple proliferation, Stolbur, Foxtail palm yel­low decline, Peanut witches’ broom and Elm yellows.

фитопатогенидентификацияПЦРфитоплазмозыплодовые культурыкарантин растенийphytopathogenidentificationPCRphytoplasmosesfruit cropsplant quarantineАвторы благодарны кандидату биологических наук Г.Н. Бондаренко (ФГБУ «ВНИИКР»), коллективу ООО «Синтол» (Россия), коллективу Института сельскохозяйственных исследований Валенсии (Institut Valencia d’Investigacions Agraries, IVIA) за предоставление материалов для исследования.The authors are grateful to PhD in Biology G.N. Bondarenko (FGBU “VNIIKR”), the Syntol team (Russia), the Valencian Institute for Agricultural Research (IVIA) team for providing materials for the study.ReferencesБашкирова И., Матяшова Г., Гинс М., 2018а. Выявление и идентификация возбудителей фитоплазмозов группы Apple proliferation на плодовых культурах. – Российская сельскохозяйственная на­ука, № 3: 10–14.Bashkirova I., Matyashova G., Gins M. Detection and identification of pathogens of phytoplasmoses of the Apple proliferation group on fruit crops [Vyyavleni­ye i identifikatsiya vozbuditeley fitoplazmozov gruppy Apple proliferation na plodovykh kulturakh]. Russian agricultural science, 2018a; 3: 10–14 (in Russian).Башкирова И., Матяшова Г., Завриев С., Ря­занцев Д., Шнейдер Ю., 2018b. Апробация тест-систем для детекции фитоплазм яблони и груши. – Защита и карантин растений, № 7: 40–41.Bashkirova I., Matyashova G., Zavriev S., Ryazantsev D., Shneyder Yu. Approval of the test systems for the detection of the apple and pear phytoplasma. Plant protection and quarantine, 2018b; 7: 40–41.Башмакова Е. Выявление однонуклеотидных полиморфизмов на основе производных Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина: автореф. дис.… канд. биол. наук: 03.01.06. – Красноярск, 2017, 22 с.Bashmakova E. Detection of single nucleo­tide polymorphisms based on derivatives of the Ca2+-regulated photoprotein obelin [Vyyavleniye odnonuk­leotidnykh polimorfizmov na osnove proizvodnykh Ca2+-reguliruyemogo fotoproteina obelina]: extended abstract of Cand. Biol. Sci. Dissertation: 03.01.06. Kras­noyarsk, 2017, 22 p. (in Russian).Гирсова Н., Кастальева Т., Можаева К. Методика определения фитоплазм с использова­нием молекулярных методов диагностики: ПЦР и ПДРФ. – М.: Россельхозакадемия, 2013, 23 с.Girsova N., Kastalyova T., Mozhaeva K. Method for determining phytoplasmas using molecular diag­nostic methods: PCR and RFLP [Metodika opredeleniya fitoplazm s ispol'zovaniyem molekulyarnykh metodov diagnostiki: PCR i RFLP]. M.: Rosselkhozakademiya, 2013, 23 p. (in Russian).Елшин Н., Петров А., 2017. Изучение возможности использования метода qPCR для кон­троля отсутствия микоплазменной контаминации в клеточных культурах. – БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 17 (3): 173–179.Elshin N., Petrov A. Possibilities of qPCR con­trol of mycoplasma contamination of cell cultures [Izucheniye vozmozhnosti ispolzovaniya metoda qPCR dlya kontrolya ot·sut·stviya mikoplazmennoy kontaminatsii v kletochnykh kulturakh]. – BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment, 2017; 17 (3): 173–179 (in Russian).Каримова Е., Приходько Ю., Шнейдер Ю., 2019. Фитоплазмы – возбудители болезней косточ­овых плодовых культур. – Защита и карантин рас­ений, № 5: 35–39.Karimova E., Prikhodko Yu., Shneyder Yu. Phytoplasma – pathogenic agents of stone fruit crops diseases [Fitoplazmy – vozbuditeli bolezney kostochkovykh plodovykh kultur]. Plant Protection and Quarantine, 2019; 5: 35–39 (in Russian).Матяшова Г., Морозова О. Методические рекомендации по выявлению и идентификации воз­будителя истощения груши Candidatus Phytoplasma pyri (Pear decline). – М.: ВНИИКР, 2016, 39 с.Matyashova G., Morozova O. Guidelines for the detection and identification of the causative agent of pear depletion Candidatus Phytoplasma pyri (Pear de­cline) [Metodicheskiye rekomendatsii po vyyavleniyu i identifikatsii vozbuditelya istoshcheniya grushi Can­didatus Phytoplasma pyri (Pear decline)]. M.: VNIIKR, 2016, 39 p. (in Russian).МСФМ 27. Международные стандарты по фитосанитарным мерам. Диагностические протоколы для регулируемых вредных организмов. ДП 12: Фитоплазмы. – 2018, 18 с.ISPM 27. International standards for phytosanitary measures. Diagnostic protocols for regulated pests. DP 12: Phytoplasmas. 2018, 18 p.Приходько Ю., Матяшова Г. Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителя пролиферации яблони Candidatus Phytoplasma mali (Apple proliferation). – М.: ВНИИКР, 2015, 80 с.Prikhodko Yu., Matyashova G. Guidelines for the detection and identification of the causative agent of apple proliferation Candidatus Phytoplasma mali (Apple proliferation) [Metodicheskiye rekomendatsii po vyyavleniyu i identifikatsii vozbuditelya proliferatsii yabloni Candidatus Phytoplasma mali (Apple proliferation)]. M.: VNIIKR, 2015, 80 p.Свиридова Л., Ванькова А., 2012. Микоплазмы – патогены растений. – Нива Поволжья, № 4 (25): 26–32.Sviridova L., Vankova A. Mycoplasmas are plant pathogens [Mikoplazmy – patogeny rasteniy]. Niva Povolzhya, 2012; 4 (25): 26–32 (in Russian).Шнейдер Ю., Приходько Ю., Шнейдер Е., Кулешова Ю. Оценка фитосанитарных рисков вредных организмов, связанных с импортирова­нием, экспортированием и перемещением саженцев, подвоев и черенков косточковых плодовых культур (под ред. Т.В. Артемьевой). – М.: ВНИИКР, 2017, 503 с.Shneyder Yu., Prikhodko Yu., Shneyder E., Kuleshova Yu. Assessment of pest risk analysis as­sociated with import, export and movement of seed­lings, rootstocks and cuttings of stone fruit crops [Otsenka fitosanitarnykh riskov vrednykh organizmov, svyazannykh s importirovaniyem, eksportirovaniyem i peremeshcheniyem sazhentsev, podvoyev i cheren­kov kostochkovykh plodovykh kultur] (ed. by T.V. Arte­myeva). M.: VNIIKR, 2017, 503 p.Bashkirova I., Bondarenko G., Kornev K., 2019. Study of methods for detecting quarantine phytoplasma’s from the apple proliferation group on the territory of Russia. – Phytopathogenic Mollicutes, 9 (1): 211–212. URL: https://doi.org/10.5958/2249-4677.2019.00106.3.Bashkirova I., Bondarenko G., Kornev K. Study of methods for detecting quarantine phyto­plasma’s from the apple proliferation group on the territory of Russia. Phytopathogenic Mollicutes, 2019; 9 (1): 211–212. URL: https://doi.org/10.5958/2249-4677.2019.00106.3.Duduk B. Molecular characterization of phy­toplasmas detected in agronomically relevant crops in Serbia. – 2009, 127 p.Duduk B. Molecular characterization of phy­toplasmas detected in agronomically relevant crops in Serbia. 2009, 127 p.IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team – Phytoplasma Taxonomy Group, 2004. Corre­spondence G. Firrao. ‘Candidatus Phytoplasma’, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects. – International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, № 54: 1243–1255. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.02854-0.IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team – Phytoplasma Taxonomy Group. Correspondence G. Firrao. ‘Candidatus Phytoplasma’, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant phlo­em and insects. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004; No. 54: 1243–1255. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.02854-0.Jarausch W., Saillard C., Dosba F., Bové J.M., 1994. Differentiation of mycoplasmalike organisms (MLOs) in European fruit trees by PCR using specific primers derived from the sequence of a chromosomal fragment of the apple proliferation MLO. – Applied and Environmental Microbiology, 60 (8): 2916–2923. URL: https://doi.org/10.1128/aem.60.8.2916-2923.1994.Jarausch W., Saillard C., Dosba F., Bové J.M. Differentiation of mycoplasmalike organisms (MLOs) in European fruit trees by PCR using specific primers derived from the sequence of a chromosomal fragment of the apple proliferation MLO. Applied and Environmen­tal Microbiology, 1994; 60 (8): 2916–2923. URL: https://doi.org/10.1128/aem.60.8.2916-2923.1994.Jomantiene R., Davis R.E., Valiunas D., Almi­naite A., 2002. New group 16SrIII phytoplasma lineages in Lithuania exhibit interoperon sequence heterogene­ity. – European Journal of Plant Pathology, 108 (6): 507–517. URL: https://doi.org/10.1023/A:1019982418063.Jomantiene R., Davis R.E., Valiunas D., Almi­naite A. New group 16SrIII phytoplasma lineages in Lithuania exhibit interoperon sequence heterogeneity. European Journal of Plant Pathology, 2002; 108 (6): 507–517. URL: https://doi.org/10.1023/A:1019982418063.Lee I.-M., Davis R.E., Gundersen-Rindal D.E., 2000. Phytoplasma, phytopathogenic mollicutes. – Annual Review of Microbiology, 54 (1): 221–255. URL: https://doi.org/10.1146/annurev.micro.54.1.221.Lee I.-M., Davis R.E., Gundersen-Rindal D.E. Phytoplasma, phytopathogenic mollicutes. Annual Re­view of Microbiology, 2000; 54 (1): 221–255. URL: https://doi.org/10.1146/annurev.micro.54.1.221.Mehle N., Nikolić P., Gruden K., Ravnikar M., Dermastia M., 2013. Real-time PCR assays for specific detection of three phytoplasmas from apple proliferation group. – Phytoplasma: Methods and Protocols, Methods in molecular biology, Vol. 938: 269–281. URL: https://doi.org/10.1007/978-1-62703-089-2_23.Mehle N., Nikolić P., Gruden K., Ravnikar M., Dermastia M. Real-time PCR assays for specific detec­tion of three phytoplasmas from apple proliferation group. Phytoplasma: Methods and Protocols, Methods in molecular biology, 2013; Vol. 938: 269–281. URL: https://doi.org/10.1007/978-1-62703-089-2_23.Mehle N., Ravnikar M., Seljak G., Knapic V., Dermastia M., 2011. The most widespread phytoplas­mas, vectors and measures for disease control in Slo­venia. – Phytopathogenic Mollicutes, 1 (2): 65–76. URL: https://doi.org/10.5958/j.2249-4669.1.2.012.Mehle N., Ravnikar M., Seljak G., Knapic V., Dermastia M. The most widespread phytoplasmas, vec­tors and measures for disease control in Slovenia. Phy­topathogenic Mollicutes, 2011; 1 (2): 65–76. URL: https://doi.org/10.5958/j.2249-4669.1.2.012.Nikolić P., Mehle N., Gruden K., Ravnikar R., Dermastia M., 2010. A panel of real-time PCR assays for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. – Molecular and Cellular Probes, 24 (5): 303–309. URL: https://doi.org/10.1016/j.mcp.2010.06.005.Nikolić P., Mehle N., Gruden K., Ravnikar R., Dermastia M. A panel of real-time PCR assays for spe­cific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Molecular and Cellular Probes, 2010; 24 (5): 303–309. URL: https://doi.org/10.1016/j.mcp.2010.06.005.Picard C., Afonso T., Benko-Beloglavec A., Karadjova O., Matthews-Berry S., Paunovic S.A., Pi­etsch M., Reed P., van der Gaag D.J., Ward M., 2018. Recommended regulated non-quarantine pests (RNQPs), associated thresholds and risk management measures in the European and Mediterranean region. – Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 48 (3): 552–568. URL: https://doi.org/10.1111/epp.12500.Picard C., Afonso T., Benko-Beloglavec A., Karadjova O., Matthews-Berry S., Paunovic S.A., Pi­etsch M., Reed P., van der Gaag D.J., Ward M. Recom­mended regulated non-quarantine pests (RNQPs), as­sociated thresholds and risk management measures in the European and Mediterranean region. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2018; 48 (3): 552–568. URL: https://doi.org/10.1111/epp.12500.PM 7/62 (3), 2020. ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Ca. P. pyri’ and ‘Ca. P. prunorum’. – Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 50 (1): 69–85.PM 7/62 (3). ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Ca. P. pyri’ and ‘Ca. P. prunorum’. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2020; 50 (1): 69–85.Seemüller E., Schneider B., 2004. ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus Phytoplasma pyri’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the causal agents of apple proliferation, pear decline and European stone fruit yellows, respectively. – International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 54: 1217–1226. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.02823-0.Seemüller E., Schneider B. ‘Candidatus Phy­toplasma mali’, ‘Candidatus Phytoplasma pyri’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the causal agents of apple proliferation, pear decline and European stone fruit yellows, respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004; Vol. 54: 1217–1226. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.02823-0.Wei W., Lee I.-M., Davis R.E., Suo X., Zhao Y., 2008. Automated RFLP pattern comparison and similarity coefficient calculation for rapid delineation of new and distinct phytoplasma 16Sr subgroup lineag­es. – International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 58: 2368–2377. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.65868-0.Wei W., Lee I.-M., Davis R.E., Suo X., Zhao Y. Automated RFLP pattern comparison and similari­ty coefficient calculation for rapid delineation of new and distinct phytoplasma 16Sr subgroup lineages. In­ternational Journal of Systematic and Evolutionary Micro­biology, 2008; Vol. 58: 2368–2377. URL: https://doi.org/10.1099/ijs.0.65868-0.Weintraub P.G., Beanland L., 2006. Insect vec­tors of phytoplasmas. – Annual Review of Entomology, Vol. 51: 91–111. URL: https://doi.org/10.1146/annurev.ento.51.110104.151039.Weintraub P.G., Beanland L. Insect vectors of phytoplasmas. Annual Review of Entomology, 2006; Vol. 51: 91–111. URL: https://doi.org/10.1146/annurev.ento.51.110104.151039.Woese C., 2000. Interpreting the universal phylogenetic tree. – Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 97: 8392–8396. URL: https://doi.org/10.1073/pnas.97.15.8392.Woese C. Interpreting the universal phyloge­netic tree. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2000; Vol. 97: 8392–8396. URL: https://doi.org/10.1073/pnas.97.15.8392.EPPO Global Database. – URL: https://gd.eppo.int (дата обращения: 19.05.2022).EPPO Global Database. URL: https://gd.eppo.int (last accessed: 19.05.2022).The National Center for Biotechnology Infor­mation. – URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (дата обращения: 21.04.2022).The National Center for Biotechnology In­formation. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (last accessed: 21.04.2022).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.